PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備？

試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度，保證PCR反應(yīng)時(shí)不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制；電泳槽：用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動(dòng)提取核酸。 這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上，才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。

公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個(gè)循環(huán)組成，每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個(gè)循環(huán)之前，通常加熱長一些時(shí)間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復(fù)性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯(cuò)誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地結(jié)合。該步驟時(shí)間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時(shí)間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

公司正在出售的產(chǎn)品：鴨肝炎病毒通用探針法熒光定量PCR試劑盒Duck Hepatitis Virus(DHV)

鴨瘟病毒探針法熒光定量PCR試劑盒Duck Plague Virus(DPV)

大腸桿菌通用探針法熒光定量PCR試劑盒(含致病性和非致病性)E.coli

細(xì)粒棘球絳蟲探針法熒光定量PCR試劑盒Echinococcus granulosus

棘球絳蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒Echinococcus spp.

鮰愛德華氏菌探針法熒光定量PCR試劑盒Edwardsiella ictaluri

愛德華氏菌通用探針法熒光定量PCR試劑盒Edwardsiella spp.

遲鈍愛德華菌探針法熒光定量PCR試劑盒Edwardsiella tarda

RT-1976(RT-76)雞減蛋綜合征病毒RT-1976探針法熒光定量PCR試劑盒Egg Drop Syndrome Virus-1976(EDSV-76)-1976

犬艾利希體（犬埃立克體）探針法熒光定量PCR試劑盒Ehrlichia canis

查菲艾利希體（查菲埃立克體）探針法熒光定量PCR試劑盒Ehrlichia chaffeensis

弗格森艾利希體（弗格森埃立克體）探針法熒光定量PCR試劑盒Ehrlichia fergusonii

里氏埃里希氏體探針法熒光定量PCR試劑盒Ehrlichia risticii

反芻獸艾利希體（反芻獸埃立克體）探針法熒光定量PCR試劑盒Ehrlichia ruminantium

艾利希體屬（埃立克體屬）通用探針法熒光定量PCR試劑盒Ehrlichiae spp.

嚙蝕艾肯菌探針法熒光定量PCR試劑盒Eikenella corrodens

艾美耳球蟲屬通用探針法熒光定量PCR試劑盒Eimeria spp.

施氏油脂線蟲探針法熒光定量PCR試劑盒Elaeophora schneideri

伊蒙微小菌探針法熒光定量PCR試劑盒Emmonsia parva

腦胞內(nèi)原蟲屬通用·探針法熒光定量PCR試劑盒Encephalitozoon spp.

溶組織內(nèi)阿米巴探針法熒光定量PCR試劑盒Entamoeba histolytica

內(nèi)阿米巴通用探針法熒光定量PCR試劑盒Entamoeba spp. 

腸道腺病毒41型探針法熒光定量PCR試劑盒Enteric Adenovirus41

腸侵襲性大腸桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒Enterinvasive E.coli(EIEC)

腸粘附性大腸桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒Enteroadhesive E.Coli(EAEC)

產(chǎn)氣腸桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒Enterobacter aerogenes

陰溝腸桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒Enterobacter cloacae

阪崎腸桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒Enterobacter sakazaki

腸桿菌屬通用探針法熒光定量PCR試劑盒Enterobacter spp.

鉛黃腸球菌探針法熒光定量PCR試劑盒Enterococcus casseliflavus

耐久腸球菌探針法熒光定量PCR試劑盒Enterococcus durans

糞腸球菌探針法熒光定量PCR試劑盒Enterococcus faecalis 

屎腸球菌探針法熒光定量PCR試劑盒Enterococcus faecium 

腸球菌通用探針法熒光定量PCR試劑盒Enterococcus spp.

比氏腸微孢蟲探針法熒光定量PCR試劑盒Enterocytozoon bieneusi 

蝦肝腸微胞蟲探針法熒光定量PCR試劑盒Enterocytozoon hepatopenaei(EHP)

腸出血性大腸桿菌O104:H4血清型探針法熒光定量PCR試劑盒Enterohemorrhagic E. coli(EHEC)

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時(shí)間：

保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時(shí)間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復(fù)性溫度和時(shí)間:

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3、延伸溫度和時(shí)間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí)，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時(shí)間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時(shí)間。這里需要注意，延伸時(shí)間過長可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時(shí)間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴(kuò)增增加。