RNA和DNA提?。?/span>

裂解：裂解公式可能因您要提取 DNA 還是 RNA 而異，但共同點(diǎn)是含有高濃度離液鹽的裂解緩沖液。

Chaotropes（離液劑）的作用：Chaotrope會(huì)破壞氫鍵及疏水間的相互作用。離液鹽包括鹽酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸鋰。

洗滌劑：除了離液劑外，裂解緩沖液中通常還有一些去污劑，以幫助蛋白質(zhì)溶解和裂解。

溶jun酶和蛋白酶K:根據(jù)樣品類型，也可以使用酶進(jìn)行裂解。

提取步驟：

1.從負(fù)八十冰箱取出樣品，放置于冰上緩慢解凍； （提前預(yù)冷離心機(jī)至4度）

2.待解凍后（紅色），加入200 μl氯仿（加入氯仿體積為Trizol體積的1/5），劇烈震蕩（乳白紅色），冰上靜置10 min。 （氯仿為有機(jī)溶劑，有效的使有機(jī)相和無(wú)機(jī)相迅速分離。有機(jī)相中主要是酚和蛋白結(jié)合，從而使得蛋白和RNA脫離，RNA進(jìn)入水相。）

3.放置于預(yù)冷離心機(jī)，離心（4度，12000 rpm，15 min），離心后可見(jiàn)明顯分三層（上層無(wú)色透明水相為RNA層，中間很薄的乳白色為DNA層，下層為紅色為蛋白層）。

4.小心緩慢吸取上清，約400 μl（寧可少吸，也不要多吸?。?，置于另一個(gè)新的1.5 ml RNase-free EP管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，常溫靜置放置15 min。

5.離心（4度，12000 rpm，15 min），可見(jiàn)白色沉淀（有時(shí)細(xì)胞較少看不到沉淀，可放置負(fù)二十或負(fù)八十兩小時(shí)再繼續(xù)后面步驟）

6.棄上清，每管加入950 ul 75% 乙醇，上下顛倒混勻（切記不要用槍吹打混勻，這樣會(huì)造成RNA溶解）。

7.離心（4度，12000 rpm，10 min），可見(jiàn)底部明顯白色沉淀。

8.離心后，棄掉上清，放入離心機(jī)再次瞬離，用10 μl 的移液器洗去殘留液體， 開(kāi)蓋晾干（約5 min）。

9.每個(gè)樣品根據(jù)沉淀大小加入適量DEPC水（一般20~30 μl，有時(shí)看不到沉淀，可加10 μl DEPC水溶解），吹打溶解RNA，十一樓酶標(biāo)儀測(cè)濃度，OD值（260/280=1.8-2.0）標(biāo)記，負(fù)八十保存。

備注：對(duì)于中性粒細(xì)胞提取RNA建議細(xì)胞數(shù)目大于2x106/樣品；

備注：操作過(guò)程中佩戴口罩。

PCR反應(yīng)五要素：
參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。
特點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：

    1.特異性：所有產(chǎn)品使用的引物均經(jīng)過(guò)詳盡的生物信息學(xué)分析，經(jīng)過(guò)GenBank及自建龐大數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，確保所用的每一條引物均為種屬或血清型特異的基因序列區(qū)段，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌種屬及血清型的特異檢測(cè)，特異性均達(dá)到佳 。

    2.   重現(xiàn)性：該系列所有產(chǎn)品均經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)菌株的驗(yàn)證，重現(xiàn)性為佳 。

    3.   靈敏性：該系列產(chǎn)品可實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)菌的高靈敏檢測(cè)，當(dāng)樣品中細(xì)菌的濃度達(dá)到103cfu/ml時(shí)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)其的直接檢測(cè)，無(wú)需繁瑣的增菌過(guò)程。

    4.   實(shí)用性：檢測(cè)范圍廣，涵蓋了對(duì)人體危害較為嚴(yán)重的17種呼吸道及腸道致病菌，可實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床樣品及其他環(huán)境取樣的快速檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程為3-4個(gè)小時(shí)。

    5.   優(yōu)勢(shì)1：序列資源豐富，除GenBank公布的序列外，公司還進(jìn)行了大量菌株的序列破譯，從理論上保證所選引物具有良好的保守性和特異性。

    6.   優(yōu)勢(shì)2：該系列試劑盒均經(jīng)過(guò)大量的保守性及特異性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，憑借公司擁有的豐富的菌種資源，每一種檢測(cè)試劑盒均經(jīng)過(guò)了20余種標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株的保守性驗(yàn)證及40余種近緣標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株的特異性驗(yàn)證，確保在使用過(guò)程中不會(huì)出現(xiàn)任何的假陽(yáng)性及假陰性報(bào)告結(jié)果。

設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：
①引物長(zhǎng)度： 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
⑤引物3’端的堿基，特別是 末及倒數(shù) 個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列 有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。

注意事項(xiàng): 

1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。

2.各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

3.請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔di一孔的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)?jiān)俪艘钥傁♂尡稊?shù)（×n×5）。

4.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

5.底物請(qǐng)避光保存。

6.嚴(yán)格按照說(shuō)明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

7.所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

8.本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

9.不能使用過(guò)期產(chǎn)品。

10. 如與英文說(shuō)明書有異，以英文說(shuō)明書為準(zhǔn)。