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血清血漿 TaqMan miRNA 反轉錄試劑盒采用加 A 法進行反轉錄，加 A 法的反轉錄效率遠高于莖環(huán)法，因此，采用該方法可極大的提高檢測靈敏度（原理見圖 1）。該試劑盒操作簡單，僅需要兩步即可輕松完成miRNA 的 cDNA 合成，合成的 cDNA 可用于所有 miRNA的后續(xù)定量檢測。反轉錄完畢后采用特異性的上游引物和接頭引物進行 PCR 擴增，F(xiàn)AM 標記 TaqMan 探針作為熒光報告基團進行定量檢測（原理見圖 1）。 的血清血漿 TaqMan miRNA 反轉錄試劑盒專用于血清血漿 miRNAs 分子的反轉錄試驗（不可用于組織和細胞），轉錄獲得的 cDNA 產物用于 TaqMan 定量 PCR 方法檢測 miRNAs 分子（僅適用 TaqMan miRNA 定量 PCR 試劑盒，。


儲存：請置于-20°C，可保存 2 年；避免反復凍融
操作方法
1 按以下組分在 0.2 ml EP 管中配制應液血清血漿 miRNA 10 μl5×TaqMan miRNA RT Solution A 2.5 μl
2 在 PCR 儀上按以下條件進行加 A 反應:37°C 30min　85°C 5min
3 反應完畢后，在上述 12.5μl 反應體系中加入如下試劑，并混合均勻。
10×PS TaqMan miRNA RT Primer 2.5 μl
10×TaqMan miRNA RT Solution B 2.5 μl
H2O 7.5 μl
4 在 PCR 儀上按以下條件進行反轉錄反應30°C 5min　55°C 60mi　95°C 5min獲得的 cDNA 產物可用于多個目標 miRNA 的檢測。通常取2μl 即可用于 HG TaqMan miRNA 定量 PCR 試劑盒檢測該試劑盒有一萬余種，詳細列表可查詢HG TaqMan miRNA qPCR kit.xls)。

PCR 反應需要使用哪些試劑和設備？

試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；
設備：
PCR儀：用于控制反應溫度，保證PCR反應時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是，只有在有序齊全的基礎上，才能進行PCR反應并得出準確結果。

PCR相關基礎實驗：

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高，產物特異性越高。復性溫度越低，產物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴增增加。

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